सिन्यूक्लिनोपैथी (पार्किंसंस रोग (पीडी); लेवी बॉडी डिमेंशिया) रोग-संशोधित उपचार एक बहुत बड़ी चिकित्सा आवश्यकता का प्रतिनिधित्व करते हैं। यद्यपि पीडी-कारण प्रोटीन α-सिन्यूक्लिन (αS) लिपिड और फैटी एसिड (एफए) के साथ शारीरिक और रोगात्मक रूप से बातचीत करता है, चिकित्सीय के लिए एफए होमियोस्टेसिस को लक्षित करना अपनी प्रारंभिक अवस्था में है। हमने पीडी-प्रासंगिक लक्ष्य स्टीयरॉयल-सीओए डेसट्यूरेज़ की पहचान की: मोनोअनसैचुरेटेड एफए संश्लेषण को रोकना पीडी फेनोटाइप्स को उलट देता है। हालांकि, लिपिड क्षरण भी एफए पूल उत्पन्न करता है। यहां, हम उम्मीदवार लक्ष्य के रूप में दर-सीमित लाइपेस एंजाइम, LIPE की पहचान करते हैं। मानव तंत्रिका कोशिकाओं में घटते LIPE ने αS समावेशन को कम कर दिया। रोगी αS ट्रिप्लिकेशन बनाम सही न्यूरॉन्स ने pSer129 और अघुलनशील αS को बढ़ा दिया था और αS टेट्रामर: मोनोमर अनुपात में कमी आई थी। LIPE निषेध ने इन सभी और असामान्य अनफोल्डेड प्रोटीन प्रतिक्रिया को बचाया। LIPE अवरोधकों ने pSer129 को कम किया और टेट्रामर को बहाल किया: αS E46K- व्यक्त मानव न्यूरॉन्स में मोनोमर संतुलन। विवो में LIPE की कमी ने कैनोर्हाडाइटिस एलिगेंस में αS- प्रेरित डोपामिनर्जिक न्यूरोडीजेनेरेशन को कम किया। सह-विनियमन एफए संश्लेषण और गिरावट पीडी फेनोटाइप को बचाने में योगात्मक साबित हुई, जो एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में सह-लक्ष्यीकरण को दर्शाता है।
परिचय
मानव सिन्यूक्लिनोपैथियों, सबसे प्रमुख रूप से पार्किंसंस रोग (पीडी) और लेवी बॉडी डिमेंशिया (एलबीडी) के लिए रोग-संशोधित उपचार विकसित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। लेवी बॉडीज (एलबी) और लेवी न्यूराइट्स पीडी के न्यूरोपैथोलॉजिकल हॉलमार्क हैं, दोनों छिटपुट (“इडियोपैथिक”) और ऑटोसोमल डोमिनेंट (पारिवारिक) रूपों में, और अल्जाइमर रोग (एडी) 1,2,3,4,5 में जमा होते हैं। α-सिन्यूक्लिन (αS) को 1997 से LB6,7 के प्रमुख प्रोटीनयुक्त घटक के रूप में फंसाया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, हाल ही के एक प्रकाशन ने LBs8 में पर्याप्त लिपिड झिल्ली घटकों की पहचान की।
लिपिड कई सेलुलर प्रक्रियाओं में मौलिक रूप से योगदान करते हैं, जिसमें झिल्ली संश्लेषण, ऊर्जा भंडारण, सिग्नलिंग और जटिल प्रोटीन संशोधन शामिल हैं। मेम्ब्रेन फॉस्फोलिपिड्स फैटी एसाइल साइड चेन से युक्त होते हैं जो कार्बन श्रृंखला की लंबाई में भिन्न होते हैं और संतृप्त या असंतृप्त हो सकते हैं, जिससे बड़े पैमाने पर झिल्ली की तरलता का निर्धारण होता है और प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को प्रभावित करता है। मस्तिष्क शरीर में दूसरा सबसे अधिक लिपिड युक्त अंग है9. लिपिड और एफए होमियोस्टेसिस तंत्रिका विकास, न्यूरोट्रांसमिशन और रिसेप्टर सक्रियण के आवश्यक निर्धारक हैं। कोशिकाएं लिपिड संश्लेषण, अग्रदूत तेज, और उप-कोशिकीय वितरण, विशेष रूप से एफए को कसकर नियंत्रित करती हैं। एक सर्वव्यापी होमोस्टैटिक तंत्र एफए का भंडारण ट्राइग्लिसराइड्स (टीजी) के रूप में साइटोप्लाज्मिक लिपिड बूंदों (एलडी) में होता है जो मुक्त एफए के संचय के कारण साइटोटोक्सिक परिणामों को रोकने में मदद करता है। एलडी डायनेमिक ऑर्गेनेल हैं जो अधिकांश प्रो- और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में मौजूद हैं। विशेष रूप से, हालांकि, एलडी न्यूरॉन्स में अपेक्षाकृत कम बहुतायत में हैं, यह सुझाव देते हुए कि एफए संश्लेषण और चयापचय शायद केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में और भी अधिक कसकर विनियमित होते हैं ताकि हानिकारक अतिरिक्त 9, 14 से बचा जा सके।
रोग-संबंधी प्रोटीन αS एक 14-kDa साइटोसोलिक पॉलीपेप्टाइड है जो न्यूरॉन्स में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। इसमें झिल्ली फॉस्फोलिपिड 15,16,17,18 और FAs19,20,21,22 के साथ शारीरिक और रोगजनक अंतःक्रियाएं हैं, और यह लिपिड होमियोस्टेसिस को बदल सकता है। αS का ओवरएक्प्रेशन एलडी गठन को बढ़ावा देता है 23, 24, 25, और एलडी सामग्री और वितरण में परिवर्तन αS विषाक्तता, न्यूरोडीजेनेरेशन, और झिल्ली तस्करी दोष 26, 27, 28 से जुड़ा हुआ है, यह दर्शाता है कि αS अभिव्यक्ति एफए होमियोस्टेसिस को प्रभावित करती है। लिपिड / एफए को विनियमित करने वाले कई जीनों में उत्परिवर्तन पीडी के बढ़ते जोखिम से जुड़े हैं, और कई लिपिड प्रजातियों को पीडी रोगी के नमूनों में 29, 30 में बदल दिया गया है। दरअसल, एक व्यवस्थित GWAS विश्लेषण ने लिपिड को कई पीडी-प्रासंगिक प्रक्रियाओं के बीच एक सामान्य कारक के रूप में प्रकट किया, जिसमें ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया, एंडोसोमल-लाइसोसोमल कामकाज, ईआर तनाव प्रतिक्रिया और न्यूरोनल डेथ शामिल हैं। सामूहिक रूप से, ये डेटा दृढ़ता से एक αS / लिपिड इंटरप्ले का सुझाव देते हैं और इस तरह मस्तिष्क में PD / LBD-प्रासंगिक αS फेनोटाइप को संशोधित करने में लिपिड / FA के लिए एक संभावित भूमिका निभाते हैं।
संस्कृति और उपचार-मानव विभेदित न्यूरॉन्स
शुद्ध एनबीएम (गिब्को 21103) में 20% डेक्सट्रोज, ग्लूटामैक्स (गिब्को 35050), और एमईएम एनईएए (इनविट्रोजन 11140-050) जोड़कर एनबीएम पूरा मीडिया तैयार किया गया था, ताकि 0.3%, 2 mM, और 1 × की अंतिम सांद्रता प्राप्त की जा सके। समाधान बाँझ फ़िल्टर किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
बीडीएनएफ, सीएनटीएफ, और जीडीएनएफ (पेप्रोटेक 450-02, 450-13, 450-10, क्रमशः) को पीबीएस में 0.1% बीएसए में भंग कर 10 g/mL समाधान बनाया गया। Y-27632 ROCK इनहिबिटर (STEMCELL Technologies 72304) को 10 mM घोल बनाने के लिए DMSO में घोल दिया गया। Doxycycline hyclate (सिग्मा D9891) बाँझ पानी में 20 mg / mL के रूप में तैयार किया गया था। निर्माता की सांद्रता में B27 (लाइफ टेक्नोलॉजीज A11138-03), पौरोमाइसिन (लाइफ टेक्नोलॉजीज A11138-03), और मैट्रीगेल (कॉर्निंग 354234) का उपयोग किया गया था। विभाज्य −20 °C पर संग्रहीत किए गए थे।
विगलन मीडिया (एनबीएम पूर्ण मीडिया जिसमें 10 μM Y-27632 ROCK अवरोधक है), प्लेटिंग मीडिया (NBM पूरा मीडिया जिसमें 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 10 ng/mL GDNF, 10 μM Y-27632 ROCK अवरोधक, 1 × B27, 5 g/mL पौरोमाइसिन, और 2 g/mL डॉक्सीसाइक्लिन हाइक्लेट), D7 मीडिया (NBM पूरा मीडिया जिसमें 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 10 ng/mL GDNF, 1×B27, 5 g/ एमएल पौरोमाइसिन, और 2 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन हाइक्लेट), और रखरखाव मीडिया (एनबीएम पूर्ण मीडिया जिसमें 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 10 ng/mL GDNF, और 1×B27) तैयार किए गए और 37 ° तक संतुलित किए गए। सी उपयोग करने से तुरंत पहले।
चढ़ाना से एक दिन पहले, प्लेटों को मैट्रीगेल मैट्रिक्स बेसमेंट मेम्ब्रेन (कॉर्निंग 354234) के साथ 34.8 g/cm2 पर लेपित किया गया था। लेपित प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस के इनक्यूबेटर में रखा गया था। चढ़ाना से ठीक पहले कुओं से मैट्रीगेल की आकांक्षा की गई थी।
